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0  引言

    自英國物理學家RobertHooke首先運用自制顯微鏡觀察到細胞結(jié)構(gòu)以來[1]，現(xiàn)在顯微鏡已經(jīng)成為觀測微觀對象形態(tài)、結(jié)構(gòu)、運動和變化的最有力和最常用的工具。但是利用傳統(tǒng)的光學顯微鏡，觀測人員只能靠目視進行分析和檢驗，不但勞動強度大、效率低，而且難以對觀測對象進行客觀記錄和準確的定位定量分析。隨著光電檢測、計算機和圖像處理等技術(shù)的發(fā)展，數(shù)字顯微圖像處理技術(shù)能夠達到排除各種主觀因素的影響，獲得定量的測量數(shù)據(jù)，更客觀地揭示生命活動的規(guī)律,因此自20世紀90年代起,逐漸成為國際發(fā)展熱點。

1  顯微細胞圖像的研究現(xiàn)狀

    采用計算機技術(shù)組成的顯微細胞圖像分析系統(tǒng)是當今國際計算機技術(shù)應(yīng)用中十分熱門的課題，尤其是計算機技術(shù)發(fā)展的速度特別快，加上開發(fā)應(yīng)用的軟件功能的不斷升級，因此世界各國，包括我國都有一定數(shù)量的科研機構(gòu)、高等院校在從事醫(yī)學、生物等領(lǐng)域的顯微細胞圖像分析系統(tǒng)的應(yīng)用研究，并推出了多種一般性的圖像處理分析系統(tǒng)(Image Analysis System , IAS),而專業(yè)的圖像細胞分析技術(shù)(Image Cytometry, ICM)(即專門用于生物組織細胞分子級甚至基因單元的量值化分析研究的技術(shù))從硬件、軟件構(gòu)成到體系結(jié)構(gòu)都要比現(xiàn)在通用的圖像處理分析系統(tǒng)復雜得多[2], 而且能代表當今國際ICM技術(shù)的、從國際知識產(chǎn)權(quán)組織提供的檢索報告上只有8份專利技術(shù)，即US 1988、US 1989、US l994、EP 1989、EP1995、JP l989、WO 1994和CN1997及24份同族專利．其中CNl997即由中國提交的發(fā)明，據(jù)悉經(jīng)實施的產(chǎn)品已作為“九五”國家科技成果重點推廣計劃指南項目．90年代初，國際ICM的代表產(chǎn)品是美國CAS公司生產(chǎn)CAS―200圖像細胞分析系統(tǒng).但這類系統(tǒng)都是以大型計算機為主機，依賴于專用硬件的支持，使得系統(tǒng)的價格昂貴，在國內(nèi)醫(yī)院難以推廣應(yīng)用；又如在流式細胞儀、顯微圖像分析儀、激光共聚焦顯微鏡、細胞掃描儀等大型儀器上可進行顯微細胞的定量分析，但這些儀器不但依靠進口、價格昂貴，而且數(shù)量少、使用不便，只能為少量重點科研項目服務(wù)，不可能在臨床診斷分析領(lǐng)域廣泛推廣。
    顯微細胞圖像的計算機自動分析研究在我國開展較晚，九十年代初時大部分研究人員集中精力在一些新算法的研究上，而忽略了實用系統(tǒng)的研制, 現(xiàn)在隨著計算機的速度不斷加快，存儲空間不斷加大，為數(shù)字顯微圖像技術(shù)的發(fā)展提供了廣泛的拓展空間, 國內(nèi)在圖像分析方面，特別是醫(yī)學病理的顯微圖像分析已有成功的經(jīng)驗。

2  顯微細胞圖像處理的基本方法

2.1顯微圖像處理過程

    顯微圖像處理的基本過程如下：
    (1)制作切片；
    (2)顯微細胞圖像采集；
    (3)圖像預處理；
    (4)圖像分割；
    (5)特征參數(shù)抽取；
    (6)統(tǒng)計分析；
    (7)結(jié)果輸出；

2.1顯微細胞圖像采集
     通過顯微鏡將切片放大，成像在攝像器材上，完成光電轉(zhuǎn)換，經(jīng)A/D轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號輸入計算機。其中攝像器材可采用電荷藕合器件(Charge coupled devices，CCD)照相機、帶有視像管(Vidicon)的視頻攝像機和掃描儀(Scanners)等。這些器件均稱為數(shù)字化器，都能將(模擬)電信號轉(zhuǎn)化為數(shù)字(離散)的形式(采集流程見圖1)。

    在圖像采集的過程中，需要注意的是：首先，由于專門針對顯微細胞圖像，其目標較小，圖像采集卡分辨率應(yīng)該盡可能高，否則，會導致細胞邊緣模糊，不利于后期分割處理；其次，顯微鏡光源的亮度對攝像機攝取病理圖像的質(zhì)量有明顯的影響；顯微鏡光源太亮或太暗所攝取的圖像因?qū)Ρ榷炔睢D像不清晰，計算機難以對測試目標進行準確分割，直接影響測量精度。所以調(diào)整好合適的顯微鏡光源的亮度對獲取高質(zhì)量的圖像，提高圖像測量精度具有重要意義。
完成光學顯微圖像――數(shù)字化顯微圖像的轉(zhuǎn)換，只是數(shù)字化顯微圖像技術(shù)的基礎(chǔ)，要得到高質(zhì)量數(shù)字化圖像分析效果，好的顯微鏡和面陣探測器、圖像卡、計算機等硬件當然是必要的，然而設(shè)計適合的通用或持殊圖像處理軟件，往往起更大的決定性作用。

2.2圖像預處理
    在數(shù)字化顯微圖像系統(tǒng)中，由于圖像數(shù)字化，以及顯微鏡、攝像器材等都會存在系統(tǒng)噪聲、干擾等等因素，原始圖像因為噪聲干擾，使圖像模糊．難以獲取關(guān)鍵的特征信息。因此必須進行除噪處理。顯微鏡光源亮度不均勻、顯微鏡光學系統(tǒng)中光束切割、攔截等光學因素、CCD器件光敏面不均勻靈敏度分布等，都會造成數(shù)字化顯微圖像灰度不均勻〔中間亮四周較暗或反之〕。這會直接導致圖像區(qū)域過飽和或邊緣圖像模糊。這些缺陷可以通過背景校正或邊緣檢測算子進行平滑濾波和邊緣檢測，將這種影響加以限制或消除。
    從根本上說，圖像處理的目的，是通過適當軟件處理使原始數(shù)字圖像得到適當變化、以適應(yīng)人的視覺信息感知和獲取特性，更便于或提高圖像有用信息的提取。消除噪聲影響后，還需進一步提高圖像的視覺效果〔圖像增強〕、進行陰影校正、改善圖像的清晰度、對比度，突出圖像的關(guān)鍵特征信息。常用的圖像增強處理方法有銳化處理、灰度變換、邊緣提取、二值化、反顯、偽彩色處理等等，曹茂永[3]等人提出了用Top-Hat算法對細胞進行了突出，以消除光照強度變化對圖像的影響。
    針對一般性圖像處理問題，可以按具體應(yīng)用要求靈活地采用一種或多種通用圖像處理技術(shù)，以及提高圖像質(zhì)量和更有效地獲得圖像中關(guān)鍵的特征信息。但在實際分析工作(尤其生物醫(yī)學試樣實時顯微分析檢測工作)中，存在種種特殊的觀測對象．提出很不一般的檢測要求，因此必須有針對性地設(shè)計開發(fā)種種特殊圖像處理技術(shù)。

2.3 圖像分割
    細胞圖像分割是將圖像中需要測量的細胞從背景中分割出來，再用計算機對分割出來的圖形進行測定，圖像分割的基本要求是分割出來的圖形或區(qū)域必須與原來的細胞或目標的大小及形態(tài)相吻合。因此，圖像分割的好壞是決定測量精度的關(guān)鍵因素之一。在通常的情況下，顯微細胞目標比例小，背景很復雜，大部分為干擾和噪聲，而不同聚焦面上目標灰度又不一致，因而顯微細胞圖像的分割，顯得十分復雜和困難。傳統(tǒng)的細胞圖象分割技術(shù)大致可分為閾值分割、邊緣檢測、區(qū)域生長等幾種方法．

2.3.1閾值分割
    通過選擇閾值將圖像分為目標和背景兩大類，閾值的個數(shù)可以選擇一個或多個，一個閾值稱為單閾值分割，選取多個閾值分割稱為多閾值方法，且圖像將被分割為多個目標區(qū)域和背景。閾值分割的優(yōu)點是算法簡單，對于不同類的物體灰度值或其它特征值相差很大時，它能很有效地對圖像進行分割，且總能用封閉而且連通的邊界來定義不交疊的區(qū)域；其缺點是不適用于多通道和特征值相差不大的圖像，對于圖像中不存在明顯灰度差異或灰度值范圍有較大重疊的圖像分割問題難以得到準確的結(jié)果，另外，由于它僅僅考慮了圖像的灰度信息而不考慮圖像的空間信息，閾值分割對噪聲和灰度不均勻很敏感．

2.3.2邊緣檢測
    邊緣檢測是通過檢測不同區(qū)域間的邊緣來解決圖像分割問題。在區(qū)域邊緣上的像素灰度值的變化往往比較劇烈，利用相鄰區(qū)域的像素值不連續(xù)的性質(zhì)，采用一階或二階導數(shù)來檢測邊緣點。用微分算子法對圖像中灰度的變化進行檢測，通過求一階導數(shù)極值點或二階導數(shù)過零點來檢測邊緣。常用的一階導數(shù)算子有梯度算子、Prewitt算子和Sobel算子，二階導數(shù)算子有Laplacian算子，還有Kirsch算子和Wallis算子等非線性算子。梯度算子不僅對邊緣信息敏感，而且對圖像噪聲也很敏感，因此，通常在求導之前先要對圖像進行濾波。邊緣檢測法的優(yōu)點是輪廓位置準確，其缺點是不能保證輪廓是封閉和單像素寬的。

2.3.3區(qū)域生長
    區(qū)域生長的基本思想是將具有相似性質(zhì)的像素集合起來構(gòu)成區(qū)域，該方法需要先選取一個種子點，然后依次將種子像素周圍的相似像素合并到種子像素所在的區(qū)域中。區(qū)域生長法雖然可以得到封閉輪廓，但是它需要人工交互以獲得種子點，這樣使用者必須在每個需要抽取出的區(qū)域中植入一個種子點；同時，區(qū)域增長方式也對噪聲敏感，導致抽取出的區(qū)域有空洞或者在局部體效應(yīng)的情況下將分開的區(qū)域連接起來；而且區(qū)域生長難以確定生長的終止條件，容易產(chǎn)生過分割。
    基于以上方法的局限性，為了更好地達到分割效果，閾值分割和區(qū)域生長都很少單獨使用，往往是與其它分割方法一起使用。近年來又提出了基于數(shù)學形態(tài)學的分割方法――水域分割(Watershed變換)法，來對血細胞[4]進行分割。周煦潼[5]等也提出了基于模糊集理論的方法對骨膜顯微圖像自動分割。

2.3.4存在離焦細胞的顯微圖像分割
    在對細胞分割算法的論文查閱中，筆者了解到，對于存在離焦細胞的顯微細胞圖像分割研究工作較少。由于細胞切片的厚度問題，必然存在聚焦細胞和離焦模糊細胞存在于同一圖像中。雖然激光共焦顯微鏡能夠克服傳統(tǒng)顯微鏡圖像模糊的缺點，但是這種設(shè)備由于其硬件系統(tǒng)價格昂貴，而且用激光激發(fā)樣本時會對樣本產(chǎn)生光漂白，因此有必要采取數(shù)字圖像的處理辦法去除原圖中模糊的細胞，只留下人們感興趣的聚焦平面的細胞。

    如圖2左所示的顯微細胞圖像中，最左邊的是完全的離焦細胞，中間的細胞右下側(cè)模糊，左半部處于焦平面上，右邊的細胞則全部處于焦平面上。由于離焦模糊使得細胞的形態(tài)特征差異變小，對基于形態(tài)特征的病理分析影響很大，因此筆者從邊緣檢測的角度出發(fā)來識別出處于焦平面上的細胞。

    步驟1.用Sobel算子求出圖像的梯度，其階躍邊緣和斜坡邊緣（對應(yīng)焦平面的細胞和模糊的細胞）經(jīng)過該運算后會得出的不同結(jié)果。
    步驟2.選擇合適的高斯模板模糊次數(shù)對圖像進行模糊。
    步驟3.再用拉氏算子求取圖像的二階梯度。
    步驟4.利用非極大值抑制技術(shù)求出二階梯度圖象局部梯度幅值極大值點，這些點的集合記為S。
    步驟5.對S中每一點，判斷其幅值是否大于閾值T，若大于這留下，小于則從S中刪掉。
    圖2右所示是該方法的結(jié)果。可以看到該方法去除了完全模糊的細胞，保留了焦平面上的細胞。

2.4特征參數(shù)抽取
    特征提取是對細胞的定量描述。特征提取和選用是否足以反映細胞類別間的差異，直接影響到分類系統(tǒng)的識別率。形態(tài)學特征參數(shù)是對細胞形狀、大小、輪廓的規(guī)則程度的定量描述。光密度特征參數(shù)是由于不同類的細胞對光的吸收程度不同，反映在細胞圖像的直方圖上就對應(yīng)不同的模式，如灰度偏向、峰谷數(shù)多少、峰值大小等。紋理特征因包含著細胞組織表面結(jié)構(gòu)排列的重要信息，而在識別中起重要作用，與其它類特征相比，它能更好地反映細胞圖像的宏觀與微觀結(jié)構(gòu)性質(zhì)。特征的選取要在細胞學家的指導下進行，才能有效地提取最能代表細胞特征的參數(shù)以區(qū)分不同種類的細胞。
    再根據(jù)已得的特征參數(shù)，作出病理判斷，或者通過建立人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對不同的細胞作出分類統(tǒng)計。

3 展望

    顯微細胞圖象處理系統(tǒng)采用現(xiàn)代光電、計算機多媒體技術(shù)．在醫(yī)用常規(guī)顯微鏡上作非破壞性的技術(shù)改造，可實現(xiàn)醫(yī)學顯微圖象動態(tài)、實時地在計算機屏幕上顯示、采集、處理分析等。新一代的顯微細胞圖象處理技術(shù)還應(yīng)在以下幾方面有所改進：

    (1) 提高數(shù)字圖像采集的清晰度，由于采集到的數(shù)字圖像的清晰度不夠高，導致在進行邊界跟蹤時，邊界走形，復雜度增加而發(fā)生錯判的缺點。這需要從顯微圖像處理系統(tǒng)的硬件入手，降低數(shù)字化顯微圖像系統(tǒng)的噪聲、干擾和檢測誤差。
    (2) 進一步發(fā)展和完善數(shù)字共焦顯微技術(shù)，以獲取的更高分辨率和質(zhì)量的樣本圖像。
    (3) 完善現(xiàn)有病理圖像分析，尤其在組織細胞的粘連和重疊等圖像處理技術(shù)上還不完善。在細胞圖像分割的分割方面，一直是一個很困難的問題，目前的自動分割方法雖然在一些方面取得了一定的成功，但還遠遠不能滿足顯微圖像處理的實踐中對分割結(jié)果準確性的要求。而且對動物的顯微病理，尤其是藥物作用后細胞組織的變化，目前還無系統(tǒng)的研究。如何針對具體應(yīng)用領(lǐng)域不同的觀測要求，開發(fā)設(shè)計適用的圖像處理技術(shù)和信息處理技術(shù)，對原始圖像進行“加工”、從中“提取”更多符合我們所要求的信息，則是數(shù)字化顯微圖像系統(tǒng)的進一步發(fā)展的要求。
    (4)開發(fā)針對性強的顯微細胞圖像分析軟件，由于生物學研究和醫(yī)學臨床分析工作中，常常會遭遇一些不同于一般圖像處理要求的特殊情況(例如觀測對象尺度小于光學顯微鏡的衍射分辨率、單個微小粒子運動情況追蹤，同時要求高時間分辨和空間分辨、染色體圖像分割和特征信息提取等)，因此，必須發(fā)展針對專門要求的顯微圖像信息處理技術(shù)，并通過實驗予以驗證。
    綜上所述，顯微細胞圖象處理技術(shù)在醫(yī)學教育、醫(yī)療、科研等方面都有廣泛的應(yīng)用前景，也是全世界大力發(fā)展的目標，應(yīng)給予充分的重視和開發(fā)。