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顯微熒光光譜成像系統的組成

顯微熒光光譜成像系統（MFSIS）包括以下幾個部分：光源，分光系統，熒光顯微鏡，圖像適配器，高性能制冷CCD攝像器件，圖像采集卡，圖像生成與處理、圖像顯示等，系統結構如圖1所示。

圖1   顯微熒光光譜成像系統結構

工作過程：高功率單色激發光源激發顯微鏡下樣品，使之發射出特定的生物熒光.依據Stocks定律，熒光波長大于激發光波長，采用光譜分光元件可以從光譜上將二者分開。在系統中可以通過對線性可變單色濾光片LVF的精確位移控制實現光譜分辨。通過LabVIEW軟件控制系統硬件改變其位置，并觸發圖像采集系統同步工作，即可獲取序列圖像—光譜圖像立方體。采集圖像信號并進行處理后，就能夠獲取微區熒光光譜掃描譜圖的詳細信息。使用在NI視覺開發模塊的基礎上所開發的顯微熒光光譜分析軟件能夠對采集來的圖像進行相關圖像處理與光譜信息分析。

顯微熒光光譜成像系統主要有三大功能模塊構成：基于LVF的分光系統控制模塊、序列圖像采集模塊和光譜圖像處理與分析模塊。

分光系統控制模塊

    光譜儀器的核心部分是色散系統，這是因為光譜儀器的四個最主要的基本特征即工作光譜范圍、色散率、分辨率和集光本領都決定于色散系統。本系統采用美國OCEAN公司的線性可變濾光片(LVF)作為色散元件，實現光譜阻斷或者通過。

分光系統的軟件部分主要是利用LabVIEW的串口工具來控制LVF的運動。主要功能包括：

※ 系統復位

※ 往復運動與指定波長位置

※ 步進工作：按照給定的間隔步長，由按鍵控制電機步進

※ 行程控制與精確定位

軟件系統中的控制窗口如圖2所示。運行時的操作過程為：給定set value的值，電機可以直接運行到指定的波長值，并且在current wavelength處實時顯示當前波長，然后根據給定的step值，點擊step按鈕，進行電機的步進。根據需要，可以隨時進行中斷并復位。運行過程中，通過busy指示燈控件反映運行的信息，當程序運行正常時，指示燈閃爍，提示等待信息；當程序發現錯誤時，指示燈停止閃爍，提示欄會提示錯誤原因。以便及時更正錯誤信息。

圖2  分光系統的控制

序列圖像采集模塊

顯微序列圖像的采集采用了美國Pixera公司的150CL型高性能冷CCD，配備圖像采集卡，但是該卡無LabVIEW驅動程序。本文中利用LabVIEW的DLL動態函數調用功能，通過對Pixera公司提供控制SDK包的調用，實現了圖像采集的曝光時間設置、自動增益調節、自動對焦、積分時間調整、黑/白平衡、彩色/灰度切換以及CCD靈敏度設置等多項功能。本文設計了圖像采集的必備子VI，其中包括CCD驅動、圖像靈敏度、制冷控制、熒光快速模式等，并將CCD采集到的圖像數據自動存入一臨時文件，采用ReadFile子VI，讀取該JPEG格式的圖像文件，顯示在位于面板右側的圖片顯示區中。

除采用軟件控制外，通過一個手動按鈕控件。控制采集卡的圖像CCD采集工作，自動完成圖像數據采集、存儲和顯示。此系統工作簡便，快速，實時性強，能夠很好地配合整個系統工作。

光譜圖像模塊

    顯微熒光光譜曲線的繪制是本系統的特點之一。如圖3所示，經過光譜掃描得到的序列圖像形成光譜立方體，其中從第0幅圖到第i幅圖分別對應不同的波長值，居于圖像中心的像素波長值分別為：λ00，λ00，……，λ0i。對于每幅圖象任意像素點，通過光譜計算可以確定其對應的波長值和光強度值，由此實現繪制圖像上任意點的光譜曲線。

圖 3  序列圖像的光譜構成

以下以FluorCell#2熒光分子探針顯微熒光光譜成像為例。首先在鏡下調整成像的照明、CCD靈敏度、手動調焦，選擇需要細節觀察的細胞區域。然后設定光譜立方體所需要的熒光采集參數、波長步進值、圖像內存區、光譜分光速度等，啟動序列圖像采集，系統將自動按照設定波長獲取相應的光譜圖像序列，并將之存儲在指定目錄下，該目錄自動設定為當前年月日時分，采集完成后可按照要求更改。系統工作界面如圖4：

圖４　Fluorcell#2的光譜圖像采集

完成圖像立方體采集后，選擇任意波長圖像上感興趣的一個區域，然后通過計算，以該區域上每個像素點的強度中值或平均值為縱坐標，波長值為橫坐標，便繪制出了光譜曲線，也稱為“面域光譜”，如上圖中右下角曲線中的白點。所選定的區域還會被標記在系統的顯示面板上。

此外，考慮到圖像立方體中圖像的個數有限，容易造成曲線的不平滑。所以，我們對光譜曲線進行擬合，采用三次樣條內插的方法，使整個曲線看起來更加平滑。如圖中右下方的曲線中紅線。

除光譜曲線繪制的功能外，軟件還增加了一些基本的圖像處理功能，用來針對圖像立方體中某一幅圖像進行處理。主要有以下功能：彩色圖像顯示，RGB直方圖，RGB閾值分割，灰度圖顯示，三維圖，反相圖，圖像增強（圖像均衡化，低通濾波，高斯濾波，平滑濾波），邊緣銳化（拉普拉斯），灰度直方圖，灰度閾值濾波，面積計算與統計，直線強度分布圖。此外，為了方便對圖像立方體中圖像的整體了解，本系統設置了圖像的Flash顯示。即，按照一定的時間間隔，順序顯示多光譜圖像。從效果來看，類似動畫播放，使觀察者對圖像上目標的動態信息變化有更好地了解。這種方法同樣可以應用于細胞形態變化的觀察。

應用實驗

1．梔子提取物抗病毒性研究

中藥梔子性味苦寒、歸心肺三焦經，能瀉火除煩、清熱利尿、涼血解毒，具通瀉三焦火邪的功效，是中醫藥用于治療溫毒疫病的要藥。病毒感染特性：病毒的感染有賴于病毒吸附蛋白(virus attachment protein，VAP )對細胞表面受體的吸附。病毒吸附蛋白是啟動病毒與宿主細胞之間相互作用、建立感染損傷細胞的必然途徑。

病毒與細胞受體的結合可以用熒光標記，將培養的人喉癌上皮傳代細胞Hep-2和病毒作用分為三組：

（1）實驗對照組y1，只加病毒，不加藥

（2）先吸附，后加藥組y2

（3）先加藥，后吸附組y3

每組按照時間間隔2秒采集圖像，得到各組的時間序列圖像組，并利用熒光光譜分析系統對圖像組進行分析：

1. 首先以兩秒為時間間隔，分別對三組細胞圖像進行采集，各采10幅圖。
2. 然后對采集來的圖像進行均衡化，平滑濾波以及高斯濾波。
3. 在濾波后的圖像上選擇目標區域，并將所選區域以及該區域對應的原始圖像區域進行顯示與保存。
4. 對圖像進行閾值濾波，以減去細胞外的背景信息。
5. 求得閾值濾波后細胞的像素面積。
6. 分別比較三種情況下細胞面積的變化。
   
             

圖５　Hep-2細胞抗病毒顯微光譜分析

如圖5所示，可以發現細胞在只加入病毒，和同時加入病毒和藥物兩種情況下變化趨勢是不同的。前者，細胞在形態上沒有明顯的變化，而后者細胞在形態上都存在較大變化，呈變大的趨勢。因此，可以認定加入梔子提取物對病毒的抑制作用很明顯。

2．茶葉熒光性綠斑病的研究

在日照、臨沂和泰安等地、市的茶園中，普遍發生一種茶樹成葉病害，其主要癥狀表現為：葉片下表皮局部異常凸起，呈綠色，而且病斑處在光照下能發綠色熒光，如圖6所示。

圖6  茶葉的綠斑病

通過對病害癥狀演化的系統觀測發現：此病害具有發綠色熒光的特性，且隨病害程度的加重，熒光增強，容易與其它一般病害的癥狀區分開來。所以，掌握和利用這一特性可以幫助我們正確辨認此種病害。我們選定其中一病變區域的熒光測定光譜如圖7。

圖7   病變區熒光光譜

總結

顯微熒光光譜成像技術是顯微光譜成像技術中一種常用的方法，對于能夠產生自體熒光和激發熒光的物質來說，顯微熒光光譜成像技術具有顯著的優勢，包括無創性，可視性，精確性等特點。

本文基于LabVIEW軟件構建的顯微熒光光譜分析系統，實現了數字圖像采集、圖像處理及生物醫學中光譜圖像分析等功能。系統功能結構復雜，所有工作在一年時間內完成，相比MSDN來說，大大節約了開發時間，且界面清潔美觀、操作方便。